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細菌脂肪酸的提取與分析

2018/9/10 10:22:28      點擊:

      試劑:  0.3%甲醛、6 mo1/1 HC1-CH3OH溶液、三氯甲烷方法:  GC- -MS 聯用分析測定,步驟如”下:
(1)菌體的培養與收集

      I組實驗菌株用YPD液體培養基培養,在培養基中添加一定量的抗凍保護劑,接種後放入30°C、150 r/ min的搖床中培養24 h。細胞振蕩培養至生長對數中期,移取適量細胞懸浮液至-30°C冰箱冷凍7d,  取出30°C 下解凍5-10min,用0.3%甲醛滅活後,  4000r / min下離心5 min,  棄去上清液,用蒸餾水洗滌,離心收集細胞,-18C冷凍, 冷凍真空幹燥製得千細胞後備用。

      空白樣用0.3%甲醛滅活後,  4000 r/ min下離心5 min,棄去上清液,用蒸餾水洗滌,離心收集細胞,-18C冷凍 24h,冷凍真空千燥製得千細胞後備用。

      II組實驗菌株用於麵包冷凍麵團的製備,添加抗凍保護劑,於-20C冷凍30d後取出解凍,取20g解凍後的麵團,分散於180ml 無菌水中,震蕩30min,  靜置15min,離心並取上清液。用0.3%甲醛滅活後,  4000r / min下離心15 min,  棄去上清液,用蒸餾水洗滌,離心收集細胞,-18C冷凍,冷凍真空幹燥製得幹細胞後備用。空白樣則不添加抗凍保護劑,其餘處理方法-樣。

(2)  脂肪酸的甲基化與提取

      取50 mg凍千細胞加入6 mol/1 HC1-CH3OH溶液2 m1,置100°C的條件下鹽酸水解甲基化3 h,溶液呈現棕褐色(或黑褐色),取出,置室溫下冷卻。加入正己烷1.5m1振蕩。經4000 r / min離心10min, 收集上清液再加入正已烷1.5m1 .抽提一次,合並兩次.上清液,加入蒸餾水3ml,經4000r/ min離心10 min,收集上清液於離心管中。用流動N2吹千,加入10μ1三氯甲烷製備脂肪酸酯化液。

(3)薄層層析

      用玻璃毛細管取脂肪酸酯化液點在矽膠G-TLC薄層板上,以正已烷+無水乙醚(1+1)為展層係統,待層析液至矽膠板上緣後立即取出薄層板,風幹。在UV254燈下檢查製備的脂肪酸純度與相對濃度。將脂肪酸甲酯帶做好標記,輕輕刮下,用二乙醚抽提兩次,經N吹千後加入0. 5ml無水甲醇振蕩溶解,然後進行GC一MS分析。 
(4)GC--MS操作條件

    程序升溫:初溫130°C,  保持1 min;  終溫280°C,維持min,升溫速度7.6°C / min。  檢測器溫度250°C;載氣(He)流速30ml / min; 分流比50: 1;流速(He)49. 9ml / min;進樣量1μl。  (2)中質譜條280°C,質量掃描範圍35-500。

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